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为了使基因片段能有效转录和翻译,5′端应接上T7启动子序列和SD序列，去掉3′端的终止密码子,从而成功地使核糖体停留在mRNA3′末端,将蛋白质和mRNA连接在一起 。在对基因片段改造时,常进行多次延伸PCR：
①分别将需要的基因片段和间隔序列各自扩出来
② 用引物 4 和引物 5 做连接 PCR 将目的基因和间隔子连接起来 ，引物5含有SD序列, 引物4含有3′端茎环结构序列。
③ PCR产物再进行延伸PCR,引物6含有T7启动子序列和5′端茎环结构序列,下游产物同前 。最后得到的PCR产物,5′端接上T7启动子和茎环结构以及SD序列,3′端则融合了间隔序列并含有3′端的茎环结构 1）体外表达可以利用来自原核的E.coliS30无细胞蛋白质合成系统,或真核的兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物的蛋白质合成系统,至于何种系统更适合,目前尚有争议.体外转录与体外翻译可以偶联进行,也可以分别进行.目前,已有以DNA 为模板的体外蛋白翻译系统和以RNA为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世 。
对于含二硫桥的ScFv抗体和其他蛋白质,转录和翻译应分别进行,因为含有二硫桥的蛋白质要在氧化条件下才能正确折叠,但转录时,T7 RNA聚合酶要求具还原性的β-巯基乙醇维持其稳定性。如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠,则体外转录/翻译偶联体系效果可能更好. 。
2）若分别进行,则需要控制RNase的影响.VRC—过渡态类似物—作为RNase抑制剂,能有效抑制核酸酶,提高E.coli核糖体展示效率 。翻译结束后立即冷却反应混合物,所有筛选步骤在冰上进行降低RNase的影响。另外,3′端和5′端的茎环结构也可以使mRNA避免核酸外切酶RNaseⅡ和核酸内切酶RNase E的影响 。 体外翻译反应结束后,将翻译混合物稀释4倍终止反应 。反应试剂中始终保持5 mmol/L Mg2+浓度 ，稳定mRNA-核糖体-蛋白质三元复合体。可以直接用于筛选实验，也可以于4℃保存 ，核糖体复合物在4℃至少可以稳定10 d ，但产量会逐渐减少。体外筛选时加入1%~2%脱脂奶粉和0.2%肝素可以降低抗原-抗体的非特异性反应,肝素还能抑制核酸酶 。
①亲和筛选
分为固相筛选和液相筛选，主要有ELISA和磁珠法 。Hanes等认为,ELISA方法中 ，抗原包被在塑料表面上 ，而塑料表面的疏水作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象，从而导致筛选出的抗体分子不能识别抗原的天然表位;磁珠法是在抗原上连接捕获标签，如生物素 ，然后在形成抗原-抗体复合物后,采用磁珠-链霉亲和素捕获该标签,进行亲和筛选。
②mRNA的分离
筛选完后 ，加入含20 mmol/LEDTA的冰冷缓冲液洗脱mRNA 。洗脱下来的mRNA用DNaseⅠ处理去除残留的DNA模板，进行RT-PCR反应重新引入T7启动子 ，SD序列等核糖体展示必需元件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交 ，评价筛选效率 。将最后一轮筛选到的靶标基因与质粒连接,转化到大肠杆菌中，可以得到单个靶标克隆。进一步采用体外或体内(分泌型或包涵体型)表达方式表达单链抗体分子,进行活性鉴定 。 用核糖体展示技术对未变异的文库进行筛选时,可以通过易错PCR或(DNA shuffering)等方法引入突变和重组技术,增加分子多样性,从而提高获得高亲和力 、良好稳定性或增加酶活性靶标分子的机率.Plückthumx小组利用核糖体展示技术筛选到1.1 nmol高亲和力的ScFv,之后通过引入DNA重排技术,又将其亲和力提高 。
什么是酶分子定向进化？有哪些方法
般采用易错PCR 、 DNA重组等技术 ，该方法旨在构建庞大的突变体文库并从中筛选阳性突变体。尽管有些声音认为该方法工作量大 ，效率低，将被淘汰 。但是笔者认为 ，没有不合适的方法 ，只有不合适的应用 。如果能配套理想的高通量筛选方案，非理性设计依然是不错的手段。例如利用营养缺陷型宿主的生长状态评估酶活；利用产物或者底物对宿主细胞的毒性（影响生长）判断酶活（生长耦合高通量筛选法）；利用荧光蛋白作为报告基因改造启动子等基因调控元件 。
理性设计：
该方法对蛋白的理化性质、三维结构 、构效关系 、催化机理等信息要求比较高 ，对计算机辅助设计依赖较大 。目前分子对接、分子动力学模拟 、量子力学等计算技术的发展为蛋白质全理性设计奠定基础。笔者认为蛋白质从头设计也应归类为理性设计 ，该方法主要通过催化空间结构的预制 、蛋白支架选择、能量计算等过程，从头设计预制功能的蛋白。但是由于该方法对信息和技术的要求较高，实现困难较大 ，目前使用单一理性设计实现蛋白质功能改造的例子不多 ，利用从头设计获得蛋白质功能提高的成功案例也较少 。
半理性设计：
对蛋白的理化性质 、三维结构 、构效关系、催化机理等信息有一定理解的基础上，在计算机辅助下 ，对活性中心或者活性口袋的热点氨基酸进行定点突变、饱和突变 、组合突变 。该方法介于非理性设计和理性设计之间 ，克服了两者的缺点，降低了技术需求。构建一定规模的突变体（~104） ，利用合理的高通量筛选方法 ，就能快速获得目标突变体 。目前，该方法应用最广泛 ，成功案例最多 。
最近两年 ，机器学习在蛋白质设计领域风生水起，作为一项技术 ，本文不对其进行分类 ，仅仅是一项蛋白质定向进化的技术。机器学习对数据量的要求较大，在蛋白质序列和结构方面的应用较为成熟，但是在结构和功能方面的应用面临较大的障碍 ，主要是样本量小的问题 ，需要配合极高通量获得改造数据 。该方法强调输入和输出，是一种黑箱模型 。其全面 、广泛应用于蛋白质功能改造 ，还需要很长的路要走。
PS：笔者在蛋白质改造中比较倾向于半理性设计 ，理性设计对个人计算能力和硬件算力要求较高，同时比较耗时 。就拿定点饱和突变举例子 ，往往实验都做完了 ，计算结果可能都没出来 。不过，湿实验与干实验结合必定是未来很长一段时间最高效的进化方法。期待机器学习在蛋白质定向进化中有所突破 ，有朝一日解放双手 。
发布于 8 月前著作权归作者所有
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酶分子定向进化:模拟自然进化过程（随机突变和自然选择）在体外进行酶基因的人工随机突变 ，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下 ，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程 。
筛选方法：平板筛选法 ，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法 ，核糖体表面展示法
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